Analytik & Handhabung von Forschungspeptiden

Reinheit und Identität

Die Qualität eines Forschungspeptids hängt an zwei Fragen: Welcher Anteil des Materials ist das gewünschte Peptid (Reinheit), und ist es das richtige Peptid (Identität)? Keine einzelne Methode beantwortet beide Fragen vollständig.

Die meisten Peptide werden heute durch Festphasen-Peptidsynthese (solid-phase peptide synthesis, SPPS) hergestellt¹. Eine Übersicht der Universität Gent ordnet die dabei typischen Verunreinigungen: Fehlsequenzen durch fehlende (Deletion) oder zusätzliche (Insertion) Aminosäuren, Diastereomere durch Racemisierung, Addukte nicht vollständig abgespaltener Schutzgruppen, Oxidationsprodukte sowie Dimere und Oligomere¹. Nach dieser Übersicht können solche Verunreinigungen bereits frühe Funktionsstudien beeinflussen und zu falschen Schlussfolgerungen führen¹.

Eine Übersicht aus der pharmazeutischen Industrieforschung beschreibt, dass synthetische Peptide Strukturveränderungen aufweisen können, die aus den Ausgangsmaterialien, dem Herstellungsprozess und der Lagerung stammen². Sie diskutiert außerdem Schwellenwerte, ab denen Verunreinigungen nach regulatorischen Leitlinien identifiziert und kontrolliert werden².

Der Weg eines synthetischen Peptids bis zur Freigabe einer Charge lässt sich vereinfacht in fünf Schritte gliedern. Nach der Synthese wird das Rohprodukt in der Regel durch präparative Umkehrphasen-HPLC aufgereinigt³. Trifluoressigsäure (TFA) dient bei der SPPS als Abspaltungsreagenz und bei der Aufreinigung als Ionenpaar-Reagenz; die Peptide fallen deshalb als TFA-Salze an⁴. Ein Methodenkapitel zur präparativen HPLC beschreibt, wie gereinigte Fraktionen gefriergetrocknet, wieder gelöst und erneut per HPLC analysiert werden³. Als Einordnung dieser Seite: Vor der Freigabe einer Charge werden die Prüfergebnisse mit festgelegten Spezifikationen verglichen; für Peptidarzneimittel werden die Schwellenwerte, ab denen Verunreinigungen identifiziert und kontrolliert werden, anhand regulatorischer Leitlinien diskutiert².

HPLC

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) trennt die Bestandteile einer Probe nach ihrer Wechselwirkung mit einer stationären Phase. Für Peptide werden vor allem Größenausschluss-, Ionenaustausch- und Umkehrphasen-Chromatographie (reversed phase, RP) eingesetzt³. Für die meisten analytischen Peptidtrennungen empfehlen die Autoren eines Methodenkapitels lineare Gradienten von wässriger TFA zu TFA in Acetonitril bei pH 2³. Detektiert wird meist im fernen UV-Bereich bei 210–220 nm, wo Peptidbindungen stark absorbieren³.

Im Chromatogramm erscheint das Zielpeptid als Hauptpeak, Verunreinigungen erscheinen als Nebenpeaks. Als Einordnung dieser Seite gilt: Eine Reinheitsangabe in Prozent bezieht sich nur auf die Bestandteile, die unter den gewählten Bedingungen getrennt und detektiert werden. Was mit dem Hauptpeak zusammenfällt oder bei der gewählten Wellenlänge nicht absorbiert, geht nicht in die Angabe ein.

Das betrifft zum Beispiel Gegenionen. TFA kann aus der Synthese oder der Aufreinigung im Endprodukt verbleiben¹. Für ihre Bestimmung wurden eigene Verfahren wie ¹⁹F-NMR, FT-IR und HPLC mit Verdampfungs-Lichtstreudetektor (ELSD) entwickelt und validiert; die Autoren betonen, dass der Gegenionengehalt bei Versuchen mit synthetischen Peptiden quantifiziert und angegeben werden sollte⁴. Eine hohe HPLC-Reinheit bedeutet daher nicht, dass die Einwaage vollständig aus Peptid besteht; dies ist eine Folgerung aus den genannten Arbeiten. Schwierig ist auch die Trennung von Isomeren: Eine Übersicht zur LC-MS behandelt Strukturisomere und Stereoisomere (Epimere) als eigene Herausforderung bei der Charakterisierung synthetischer Peptide².

Massenspektrometrie

Die Massenspektrometrie (MS) misst das Verhältnis von Masse zu Ladung ionisierter Moleküle. Für die Identitätsprüfung wird die gemessene Masse mit der Masse verglichen, die sich aus der Sequenz berechnet. Als Einordnung gilt: Die Masse allein unterscheidet nicht zwischen Molekülen gleicher Zusammensetzung, etwa Epimeren, die in der Literatur gesondert behandelt werden².

Mehr Information liefert die Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS). Dabei werden Peptide in der Gasphase fragmentiert, am häufigsten durch stoßaktivierte Dissoziation (collision-activated dissociation, CAD); als Alternativen sind die Infrarot-Multiphotonen-Dissoziation und die Elektroneneinfang-Dissoziation beschrieben⁵. Aus den typischen Fragmentionen lassen sich Rückschlüsse auf die Sequenz ziehen⁵.

In Kopplung mit der Flüssigchromatographie (LC-MS) lassen sich auch Verunreinigungen synthetischer Peptide identifizieren. Eine Übersicht schlägt dafür einen systematischen LC-MS-Arbeitsablauf vor, bewertet absolute und relative Quantifizierungsmethoden und beschreibt typische Fallstricke². Vereinfacht, als Einordnung dieser Seite: Die HPLC beantwortet vor allem die Frage nach der Reinheit, die MS die Frage nach der Identität.

Das Analysezertifikat (COA)

Ein Analysezertifikat (Certificate of Analysis, COA) dokumentiert die Prüfergebnisse einer bestimmten Charge. Typischerweise enthält es die folgenden Angaben:

• Chargennummer: ordnet das Dokument eindeutig einer Produktionscharge zu.
• Prüfmethoden: nennen die eingesetzten Verfahren, etwa HPLC und MS, idealerweise mit den wesentlichen Messbedingungen.
• Reinheit per HPLC: als Prozentwert, häufig mit beigefügtem Chromatogramm; zur Methode siehe den Abschnitt HPLC³.
• Identität per MS: gemessene Masse im Vergleich zur aus der Sequenz berechneten Masse, häufig mit Spektrum; zur Methode siehe den Abschnitt Massenspektrometrie.
• Datum: der Analyse bzw. der Ausstellung.
• Unterschrift bzw. Labor: nennt das verantwortliche Labor und die freigebende Person.

Beim Lesen eines COA ist zu beachten, dass die HPLC-Reinheit nichts über den Gehalt an Gegenionen aussagt; dessen Quantifizierung und Angabe bei Versuchen mit synthetischen Peptiden halten die Autoren einer Methodenarbeit für wichtig⁴. Die Analysezertifikate von AUREON sind chargenbezogen.

Lyophilisierung

Die Lyophilisierung (Gefriertrocknung) entfernt Wasser aus einer gefrorenen Probe unter vermindertem Druck. Eine Grundlagenarbeit beschreibt den Glasübergang als das physikalische Ereignis, das dem Kollabieren des Produkts während der Gefriertrocknung zugrunde liegt⁶. Schon kleine Änderungen der Zusammensetzung, etwa von pH-Wert, Puffersalz oder Konzentration, können das Gefrier- und Trocknungsverhalten deutlich verändern; die Autoren raten deshalb zu möglichst einfachen Formulierungen⁶.

Der Zweck liegt in der Stabilität: Peptide sind in wässriger Lösung häufig instabil, und eine trockene Formulierung, die erst bei Bedarf rekonstituiert wird, ist eine Möglichkeit, dem zu begegnen⁷. Folgenlos ist die Gefriertrocknung jedoch nicht: Nach einer Übersicht zur Aggregation von Peptiden zählt sie neben Temperatur, Druck und mechanischer Belastung zu den physikalischen Faktoren, die die physikalische Stabilität beeinflussen⁸.

Die Gefriertrocknung wird auch für den Austausch von Gegenionen genutzt. In einer Methodenstudie wurde TFA durch Chlorid ersetzt, indem die Peptide in Salzsäure unterschiedlicher Konzentration gefriergetrocknet wurden; die Reinheit der Peptide veränderte sich dabei nicht⁴.

Rekonstitution

Rekonstitution bezeichnet das Auflösen eines Lyophilisats in einem Lösungsmittel für die weitere Laborarbeit. Welches Lösungsmittel geeignet ist, hängt vom Peptid ab. Eine Übersicht zu wässrigen Peptidlösungen nennt die Wahl des pH-Werts und eines geeigneten Puffers als die praktikabelsten Ansätze, um den Abbau zu verlangsamen⁷. Ob Peptide aggregieren, hängt unter anderem von Konzentration, pH-Wert, Nettoladung und dem Kontakt mit Oberflächen und Grenzflächen ab; auch mechanische Belastung durch Rühren oder Schütteln ist als Einflussfaktor beschrieben⁸.

Bakteriostatisches Wasser ist steriles Wasser mit einem Konservierungsmittel; in der hier zitierten Literatur ist das Benzylalkohol^9,10. Konservierungsmittel sollen mikrobielles Wachstum in Behältnissen verhindern, aus denen mehrfach entnommen wird¹⁰; im Labor betrifft das nach Einordnung dieser Seite etwa Stammlösungen, die über mehrere Versuche hinweg verwendet werden. In einer Studie zur Rekonstitution von Lyophilisaten wurde eine bakteriostatische Konzentration von 0,9 % (w/v) Benzylalkohol in Wasser verwendet⁹. Nach einer Übersicht zu Konservierungsmitteln hemmen mikrobiostatische Stoffe das Wachstum von Mikroorganismen, während mikrobizide Stoffe sie irreversibel abtöten¹⁰. Benzylalkohol wirkt nach dieser Übersicht am besten unterhalb von pH 5 und kaum noch oberhalb von pH 8¹⁰.

Konservierungsmittel sind nicht mit jedem Peptid verträglich. Für bestimmte Konservierungsmittel ist eine verstärkte Partikelbildung von Proteinen und Peptiden beschrieben¹⁰. Bei einem gefriergetrockneten Protein, dem rekombinanten Interleukin-1-Rezeptorantagonisten, führte das Lösen mit Benzylalkohol-Lösung zu stärkerer Aggregation als das Lösen mit Wasser; das Ausmaß hing davon ab, wie gut die Proteinstruktur bei der Gefriertrocknung erhalten geblieben war⁹. Ob sich ein solcher Befund an einem Protein auf ein bestimmtes Peptid übertragen lässt, ist im Einzelfall zu prüfen.

Lösungsmittel und Gefäße sollten steril sein, und es sollte aseptisch gearbeitet werden. Die genannte Übersicht betont, dass ein Konservierungsmittel aseptisches Arbeiten nicht ersetzt¹⁰.

Die Konzentration einer Lösung ergibt sich aus der gelösten Peptidmenge geteilt durch das Volumen. Bei gleicher Menge führt ein größeres Volumen zu einer niedrigeren, ein kleineres Volumen zu einer höheren Konzentration. Enthält die Einwaage neben dem Peptid auch Gegenionen, liegt die tatsächliche Peptidkonzentration unter dem rechnerischen Wert; dies ist eine Folgerung aus den Angaben zu Gegenionen⁴.

Lagerung & Stabilität

Peptide verändern sich auch nach der Herstellung. Chemische und physikalische Instabilität hängen dabei zusammen: Eine Übersicht zu Peptiden nennt chemischen Abbau als einen der Faktoren, die die Aggregation beeinflussen⁸; eine Übersicht zur Stabilität von Proteinarzneimitteln behandelt dieses Zusammenspiel ausdrücklich¹¹. Zu den chemischen Abbauwegen zählen unter anderem Oxidation, Deamidierung und Spaltung der Peptidkette^1,7.

• Oxidation: Sie wird nach einer Übersicht zu wässrigen Peptidlösungen durch Spuren redoxaktiver Metalle, Lichteinwirkung, pH-Wert, Temperatur und Pufferzusammensetzung beeinflusst; besonders anfällig sind Cystein und Methionin, daneben Tryptophan, Tyrosin und Histidin⁷.
• Deamidierung und Kettenspaltung: Beim rekombinanten menschlichen Parathormon war unter sauren Bedingungen die Spaltung an Aspartat, oberhalb von pH 5 die Deamidierung von Asparagin der vorherrschende Abbauweg⁷.
• Feuchtigkeit im Lyophilisat: Bei gefriergetrocknetem Insulin traten unter erhöhter Temperatur und Feuchtigkeit kovalente und nichtkovalente Aggregation auf; der kovalente Prozess beschleunigte sich mit steigender Temperatur und steigendem Wassergehalt, und das Ausmaß der Aggregation korrelierte direkt mit der Wasseraufnahme des Pulvers¹².

Aus diesen Befunden leitet sich als Einordnung dieser Seite ab, Lyophilisate trocken, verschlossen, lichtgeschützt und kühl zu lagern; es handelt sich nicht um das Ergebnis einer Stabilitätsstudie zu einem bestimmten Forschungspeptid. Auch die Vorhersage der Haltbarkeit ist begrenzt: Die Autoren einer Grundlagenarbeit zur Gefriertrocknung halten ein besseres Verständnis für nötig, um die Stabilität bei der vorgesehenen Lagertemperatur aus beschleunigten Stabilitätsdaten bei höheren Temperaturen abzuleiten⁶.

Für gelöste Peptide gilt, dass sie in wässriger Lösung häufig instabil sind⁷. In der Studie zum Interleukin-1-Rezeptorantagonisten, einem Protein, beschleunigte Benzylalkohol die Aggregation während der Lagerung der gelösten Proben bei Raumtemperatur nicht; die Autoren halten es für möglich, das Risiko einer durch das Konservierungsmittel ausgelösten Aggregation durch eine Lagerung bei reduzierter Temperatur zu verringern⁹. Für Peptide ist das nicht untersucht.